Медленно-медленно колесо хорватской бюрократии поворачивалось в нашу пользу. Восьмого декабря 2006 года после множества проволочек, для меня в основном непостижимых, был подписан меморандум о соглашении между Хорватской и Берлинской академией наук. Я прямо не верил! Наконец-то дорога к вожделенным костям расчищена! При первой же возможности я организовал поездку в Загреб. Поехали мы с Йоханнесом и Кристин Верна, молодой француженкой, палеонтологом из отдела эволюции человека в нашем институте в Лейпциге. Ей предстояло провести в Институте четвертичной палеонтологии и геологии десять дней и составить предварительный каталог костей неандертальцев из коллекции Виндии.
Рис. 12.2. Павао Рудан, Желько Кучан и Иван “Джонни” Гушич, трое членов Хорватской академии наук, которые помогли нам с образцами неандертальских костей из пещеры Виндия. Фото: Павао Рудан, HAZU
Мы с Йоханнесом пробыли в Загребе четыре дня и вернулись в компании Павао, Желько и Джонни, а у Джонни в чемоданчике лежали стерильные упаковки с восемью вожделенными костями, и среди них знаменитая Vi-80, теперь официально переименованная Vi-33.16 (рис. 12.1).
Мы прибыли в Лейпциг поздно вечером. А с утра первым делом отнесли кости к нам в отдел эволюции человека, где их, не вынимая из упаковок, просканировали на томографе — теперь их морфологическое строение навечно зафиксировано в электронном виде. А потом в игру вступил Йоханнес и забрал кости в “чистую комнату”.
Рис. 12.3. Отбор проб из неандертальской кости стерильным буром. Фото: MPI-EVA
С помощью стерильного зубоврачебного сверла он удалял два-три миллиметра поверхности с каждой из костей. Затем сверлил маленькую дырочку до плотной внутренней части кости. Ему приходилось часто останавливаться, чтобы сверло не нагрелось и чтобы из-за нагрева не потерять потенциальную ДНК (рис. 12.3). Ему требовалось примерно 0,2 грамма костного материала; этот материал опускался в раствор, который в течение нескольких часов растворял и связывал костный кальций. От кости оставались комочки белков и других неминеральных компонентов, ДНК же попадали в раствор, то есть в жидкую часть смеси. Йоханнес изолировал молекулы ДНК, соединяя их с кремнием — этот метод четырнадцать лет назад с успехом применял Матиас Хёсс для выделения ДНК из древних костей.
Чтобы подготовить молекулы ДНК для секвенирования по методу 454, Йоханнесу нужно было с помощью определенных ферментов убрать раскрученные и одиночные кусочки нитей ДНК на концах. Потом, используя следующий фермент, он пришивал к концам древних фрагментов специально синтезированные короткие отрезки современной ДНК, так называемые адаптеры. С присоединенными адаптерами отдельные фрагменты ДНК можно было “читать” на секвенаторе, как книгу; коллекция таких прочтенных “книг” складывалась в библиотеку. Адаптеры специально синтезировали для нашего проекта: они содержали короткую последовательность из четырех оснований, ТГАЦ, и эта цепочка должна была оказаться на стыке синтезированной и древней ДНК и служить своеобразным маркером искомых фрагментов. Это была одна из тех незаметных технических мелочей, которые часто играют огромную роль в продвижении молекулярной биологии в целом и в области исследования палео-ДНК в частности. Мы применили эти маркеры, так как наши библиотеки древних ДНК должны в какой-то момент покинуть чистые помещения и отправиться на секвенаторы 454. Чтобы наверняка быть уверенными, что ДНК из других библиотек, с которыми мы работаем в лаборатории, не попали в неандертальские библиотеки, мы будем обращать внимание только на те последовательности, которые начинаются с ТГАЦ. Идею адаптеров мы разработали и опубликовали в 2007 году[53].