Окончив гимназический курс, Н. Костомаров в августе 1833 года, выдержав вступительные экзамены, поступил на словесное отделение Харьковского университета, где и продолжал учебу до августа 1836 года. Трехлетний срок обучения был тогда обычным для трех факультетов: этико-политического, словесного и физико-математического. Студенты медицинского факультета учились четыре года. По новому университетскому уставу 1835 года в организацию учебного процесса российских университетов (Московского, Казанского и Харьковского) были внесены изменения. Университеты имели три факультета: философский, юридический и медицинский, причем философский факультет состоял из двух отделений: историко-филологического и физико-математического, со своими деканами. Как главный курс студентам первого отделения философского факультета читалась всеобщая история и как дополнительный – студентам юридического факультета.
В то время Костомаров квартировал в доме профессора латинского языка п. И. Сокальского, что и предопределило интерес студента к языкам, особенно латинскому, французскому, итальянскому. Николай Иванович про этот период говорит так: «В первый год моего пребывания в университете я усиленно занялся изучением языков, особенно латыни, которую очень полюбил, и вообще меня стал сильно привлекать античный мир. Воображение мое постоянно обращалось к Древней Греции и Древнему Риму, к их богам, героям, к их литературе и памятникам искусства. Однажды, читая „Илиаду“ в подлиннике с переводом Гнедича, мне вздумалось разыграть в лицах сцену, как Ахилл волочил тело Гектора вокруг стен Илиона. Я подговорил своих товарищей, мы нашли маленькую повозку, на которой няньки возили детей Сокальского. Я упросил привязать меня за ноги к этой повозке; один из моих товарищей стал играть роль Ахилла и потащил меня вниз по деревянной лестнице флигеля, где мы жили, а двое других, покрывши головы по-женски, стали на террасе того же флигеля и представляли Гекубу и Андромаху. Меня поволокли с лестницы по двору. Стук, гам и крик дошли до ушей Сокальского, который в то время сидел с гостями; он выбежал во двор, за ним его гости – профессора, бывшие у него. Увидавши неожиданную сцену, Сокальский сначала принял менторский суровый вид, но потом, узнав, в чем дело, не вытерпел и захохотал во весь голос. За ним начали смеяться и его гости. Меня развязали, и я заметил, что голова моя была в крови, как, впрочем, и следовало по „Илиаде“, где говорится: „…глава приамида, прежде прекрасная, бьется во прахе“. Когда после того мы пошли к нему обедать, он, глядя на меня, не мог удержаться от смеха и говорил своим домашним: „Вот угостили меня! Дали возможность повидать древность в лицах!“»
Совершенное овладение многими языками способствовало глубокому изучению молодым Костомаровым сочинений Ж.-Ж. Руссо, А. К. Сен-Симона, произведений В. Гюго, И. Гете, В. Скотта, В. Шекспира, Ф. Шиллера, трудов польских, чешских, словацких, болгарских, сербских прогрессивных писателей и общественных деятелей, сыгравших важную роль в формировании его мировоззрения. Восхищаясь сочинениями Ж.-Ж. Руссо, Н. И. Костомаров по поводу официально-охранительной точки зрения русского самодержавного общества замечал, что «зло не в Ж.-Ж. Руссо, а в невежественных читателях его произведений».
В жизни Харьковского университета 1835 год был знаменателен, по свидетельству Н. И. Костомарова, тем, что кафедры пополнились новыми молодыми преподавателями.
Именно в этот период происходит формирование научных интересов Н. И. Костомарова. Наибольшее влияние на формирование его как историка оказали лекции профессора всеобщей истории М. М. Лунина, отличавшиеся «богатством содержания и критическим направлением», под влиянием которых, по его замечанию, он с жаром предался чтению и изучению исторических книг. Обучаясь на третьем курсе (1835–1836) и проживая в доме известного украинского поэта П. П. Гулака-Артемовского, бывшего тогда профессором русской истории Харьковского университета, Н. И. Костомаров с большим увлечением занимался историей, много читал «всевозможных» исторических книг, так как хотел знать «судьбу всех народов». Литература в то время также интересовала его, но уже «с исторической точки ее значения». Вспоминая впоследствии годы учебы в университете, ученый отмечал, что «если бы не было в университете Лунина, то время, проведенное в звании студента, надобно было бы считать потерянным».