По мере прогрессировавшего на протяжении всей первой половины XV в. упадка Византийской Империи одна за другой предпринимались все новые попытки объединить христианские державы против турок, неизменно оканчивавшиеся провалом. Между тем, Родос снова и снова подвергался нападениям мусульман. При этом турки проводили как бы «разведку боем», на практике изучали особенности тактики рыцарей Родоса и готовились к решающему удару. Могущественный Египет также стремился избавиться от рыцарей Родоса раз и навсегда, поскольку Орденский флот грабил египетские корабли и тем самым причинял огромный ущерб египетской экономике. В 1440 г. египетский флот, под предлогом того, что «Родос в древние времена зависел от Египта», захватил принадлежавший Ордену о. Кастеллоризо. Затем 18 египетских галер атаковали Родос. Маршал Ордена, возглавивший флот родосских рыцарей, вышел из гавани и, хотя Орденский флот значительно уступал египетскому, вступил в сражение с неверными. Морской бой продолжался целый день, пока ночная темнота не принудила флоты противников разделиться. Потери госпитальеров составили не более 70 человек убитыми и ранеными, потери мамелюков — более 700 человек. Египетский флот установил блокаду островов Родос и Кос. Однако рыцарям Родоса удалось прорвать эту блокаду и вынудить египтян отступить. В 1444 г. последовало новое нападение египтян на Родос. Восемнадцатитысячная армия мамелюков осадила столицу Родоса, а египетский флот блокировал гавани госпитальеров, но неоднократные штурмы не принесли удачи египтянам. Осада продолжалась 40 дней. Боевые действия на море шли с переменным успехом, пока в 1445 г. не был заключен мирный договор между Орденом и Египтом и произведен обмен военнопленными.
В 1453 г. турки-османы после продолжительной и кровопролитной осады захватили Константинополь (при этом погиб в бою последний византийский автократор). Родосское государство госпитальеров осталось последним, серьезным противником турок в Восточном Средиземноморье. Теперь и рыцари Родоса окончательно уяснили себе — враг у ворот, и для них началась борьба не на жизнь, а на смерть. Осознание этого госпитальерами выразилось, в частности, в титанических усилиях Великих Магистров, направленных на то, чтобы максимально укрепить фортификационные сооружения столицы и гаваней Родоса, усилить прочие крепости, расположенные как на острове за пределами столицы, так и на других островах, относившихся к числу орденских владений, расширить склады продовольствия, вооружения и боеприпасов. Путем издания соответствующих законов Орден пытался создать, хотя бы в общих чертах, план обороны города и селений. В 1465 г. Великий Магистр П. Р. Закоста разделил крепостные стены столицы Родоса на участки, каждый из которых надлежало оборонять одному из «языков» Ордена. К 1467 г. госпитальеры возвели на Родосе много новых укреплений. Были выкопаны дополнительные рвы и сооружена новая стометровая стена высотой до 10 м. В 1474 г. Джованни Батиста дельи Орсини, а в 1479 г. — Пьер д’ Обюссон определили, в каких крепостях надлежит укрыться сельскому населению Родоса в случае вражеского нападения.
В ожидании турецкого нашествия рыцари Родоса предпринимали все возможное для выигрыша времени. В 1455 г. Орден Святого Иоанна отправил посольство к Адрианополь к султану Мехмету II Завоевателю для ведения мирных переговоров. Но Мехмет II в качестве «цены мира» потребовал от госпитальеров уплаты дани в размере 2000 дукатов ежегодно и признания верховного суверенитета султана над Родосом. Великий Магистр с согласия Совета отвечал ему, что корпус Ордена состоит из воинов-монахов, подчиненных христианскому первосвященнику-папе, что рыцари приобрели остров Родос ценой своей крови, и что все члены Ордена с радостью пожертвуют жизнью для защиты Христианского Закона. В ответ на этот дерзкий, с точки зрения турок, отказ турецкая флотилия из 30 галер в 1456 г. напала на принадлежавшие Ордену Святого Иоанна острова Кос и Сими. В 1457 г. турки внезапно высадились на востоке острова Родос и разграбили селение Архангелос. Госпитальеры контратаковали турок, многих перебили и взяли в плен, а остальных вынудили вернуться на свои корабли и удалиться. Вскоре турецким нападениям подверглись и другие островные владения рыцарей Родоса — Тилос, Нисирос, Jlepoc и Калимнос. По распоряжению Великого Магистра все жители мелких островов были эвакуированы на Родос, чтобы, с одной стороны, спасти их от угрозы верной смерти или продажи в рабство, а с другой — увеличить за их счет число защитников главного острова архипелага, на который были стянуты все боеспособные силы Додеканеса.