Еще в первой половине XVI века от Панамы была проложена через перешеек мощеная столбовая дорога к Караибскому побережью, где перевалочным центром стал Номбре-де-Дьос. В середине XVI века для облегчения пути была использована река Чагрес, по которой курсировали плоскодонные лодки.
Однако многократные перегрузки крайне затрудняли и удорожали перевозку; поэтому, как только было окончательно установлено отсутствие в Центральной Америке пролива, связывающего Атлантический океан с Тихим, начали появляться проекты создания канала между ними. Первый из этих проектов принадлежал одному из соратников Бальбоа — Альваро де Сааведра Серон, который в 1529 году предложил прорыть канал через перешеек почти в том же месте, где ныне проложен Панамский канал. Идея Сааведры заинтересовала испанского короля Карла V (бывшего в то же время германским императором); он приказал обследовать перешеек и установить возможность проведения здесь канала. К середине XVI века были уже выявлены те четыре места, где мог бы пройти канал. Но Испания шла уже под гору. Все сильнее становились ее соперники на море, в частности Англия, которая несколько позже, в 1588 году, нанесла Испании сильнейший удар, уничтожив ее мощный флот — «непобедимую Армаду». Быстрый рост морского могущества Англии вызывал у испанского короля Филиппа II, сына и наследника Карла V, боязнь, что, если канал будет проведен, у Испании не хватит сил удержать его за собой, и лучший путь к тихоокеанским владениям Испании — «ключи мира», по выражению известного английского моряка и пирата Дрейка, — окажется в руках ее смертельного врага — Англии. Под эти весьма материальные соображения Филипп II подвел «духовную.» базу, заявив: «что бог соединил, человек да не разъединяет», и на этом основании запретил под страхом смерти заниматься проектами и изысканиями для строительства канала.
Опасения Филиппа II подкреплялись все более частыми нападениями английских пиратов на испанские суда, доставлявшие в Испанию сокровища Нового Света. Не помогало ни вооружение судов, ни отправка их целыми эскадрами, под защитой военных кораблей. Вскоре английские пираты при поддержке правительства перешли к нападениям на испанские базы в Америке. Большую помощь им оказывали порабощенные испанцами индейцы и негры, видевшие в пиратах союзников в борьбе со своими угнетателями.
Особое внимание англичане уделяли Панамскому перешейку. Они неоднократно захватывали и грабили Номбре-де-Дьос, а позже Пуэрто-Бельо, сменивший Номбре-де-Дьос в качестве караибской оконечности дороги через перешеек. В 1671 году английские пираты под руководством Генри Моргана пересекли перешеек, захватили город Панаму, разграбили и сожгли его. От города осталась только груда развалин. В награду за «подвиги» английский король произвел Моргана в дворянство, назначил вице-губернатором острова Ямайки и поручил ему… охрану морского судоходства от пиратов.
Испанцы построили в нескольких километрах от разрушенной Морганом старой Панамы новый город, также названный Панамой и существующий до настоящего времени. Однако из-за постоянной угрозы нападения пиратов значение пути через Панамский перешеек постепенно падало. В XVIII веке торговля Испании с ее тихоокеанскими владениями велась обходным путем, вокруг Южной Америки, лишь небольшая ее часть проходила через Панаму, ставшую далекой окраиной испанского вицекоролевства Новая Гранада, ядром которого была нынешняя Колумбия.
Развитие капитализма и рост мировой торговли привели к тому, что с конца XVIII века идея сооружения канала через Центральную Америку стала постепенно приобретать все более широкое распространение. Испанское правительство сняло двухсотлетний запрет и приступило к изысканиям с целью выбора лучшей трассы для канала, однако час испанского владычества уже пробил: захват Испании Наполеоном, а затем отделение американских колоний от Испании сорвали реализацию этих планов.