Через два месяца, 4 февраля 1843 года, о.Амвросий был рукоположен в иеродиакона, а 9 декабря 1845 года - в иеромонаха. Сам о.Амвросий считал себя недостойным диаконского сана, а тем более - священства. Живя около старцев, он видел, что священнослужитель не только исполнитель священных действий, но и пастырь овец словесных. Пример старцев показывал всю сложность и ответственность этого подвига. Но не трудности пугали о.Амвросия, а ощущение собственного недостоинства и неподготовленности к этому высокому служению. Свои мысли он высказывал старцам, которые давали утешительные наставления во всем полагаться на Промысел Божий и Его милосердие.
Служение о.Амвросия у престола всегда сопровождалось чувством глубокого благоговения. Так, много лет спустя он говорил одному немощному иеродиакону, который тяготился отправлением чреды священнослужения: "Брат! Не понимаешь дела, - ведь жизни причащаешься".
Однако о.Амвросию недолго суждено было приносить Господу бескровную жертву. С первых дней после посвящения его постигла болезнь, которая со временем навсегда лишила его возможности и утешения совершать Божественную литургию. Еще в декабре 1845 года при поездке в Калугу для посвящения во иеромонаха он простудился и стал чувствовать постоянное недомогание. Однако сразу вылечиться не мог, так как новорукоположенному необходимо было постоянно участвовать в богослужении. По временам он бывал так слаб, что не мог долго держать потир в руке, и, как старец рассказывал сам, ему иногда приходилось прерывать приобщение народа, возвращаться на время в алтарь и ставить чашу на престол, чтобы дать отойти онемевшей руке.
В сентябре 1846 года о. Амвросий выехал по Белевской дороге за 18 верст от Оптиной навстречу Курскому архиепископу Илиодору, которого он должен был пригласить посетить обитель, а 17 сентября заболел так серьезно и пришел в такое изнеможение, что 26-го октября во время утрени был особорован и приобщен Св. Христовых Тайн. В это время он был келейно пострижен в схиму с сохранением имени Амвросия. Болезнь затягивалась, лечение не помогало, и в декабре 1847 года он заявил, что желает остаться в обители за штатом. Только летом 1848 года после почти двухлетней жестокой болезни о.Амвросий стал выздоравливать и выходить на воздух.
Эта тяжелая и продолжительная болезнь была явным действием Промысла Божия. Еще перед этой болезнью, летом 1846 года, о.Амвросий, тоже по причине болезненного состояния, освобождается от келейничества и, по ходатайству о.Игумена Моисея и старца Макария, получает от архиепископа Николая назначение быть помощником о.Макарию в духовничестве. В это время о.Амвросию было только 34 года, но старцы монастыря видели, что он в своей духовной жизни достиг высоких степеней нравственного совершенства и сможет принести большую пользу нуждающимся в духовном руководстве. Постигшая о.Амвросия тяжелая болезнь имела большое значение для его духовной жизни: она умерила живость его характера, предохранила его, быть может, от развития в нем самомнения и побудила его глубже войти в себя, лучше понять самого себя и человеческую природу. Болезни не покидали его до последних дней его жизни.
Несмотря на свои многочисленные болезни, о.Амвросий не только никогда не скорбел о них, но считал их необходимыми как лучшее средство для воспитания души. И насколько его внешний человек предавался тлению, настолько внутренний обогащался духом.
В это время одновременно с помощью старцу Макарию в духовничестве о.Амвросий вместе с другими учеными братиями занимался переводом святоотеческих писаний и подготовкой их к изданию. Эти труды продолжались вплоть до самой смерти иеросхимонаха Макария (7 сентября 1860 г.). Были изданы писания преподобных отцов: Нила Сорского, Варсонофия Великого и Иоанна, Симеона Нового Богослова, Феодора Студита, Максима Исповедника, Исаака Сирина, аввы Фаласия и аввы Дорофея; всех изданий было шестнадцать. Только один перечень имен святых отцов показывает, какими обширными познаниями обогатился о.Амвросий, участвуя в этой работе.