В 1863 году Д. И. Менделеев получил место профессора Петербургского практического технологического института, а с 1866 года — Петербургского университета, где читал лекции по органической, неорганической и технической химии. Кроме того, он преподавал и в других учебных заведениях, среди которых следует отметить Владимирские женские курсы. Д. И. Менделеев принял живейшее участие в организации известных Бестужевских женских курсов.
В 1865 году Д. И. Менделеев защитил диссертацию на степень доктора химии на тему «О соединениях спирта с водой», где, в частности, определил оптимальный градус для русской водки — 40.
В 1869 году Д. И. Менделеев открыл периодический закон выпустив знаменитый труд «Основы химии», выдержавший затем многочисленные издания на русском, английском, немецком, французском и других языках.
Главным делом жизни Д. И. Менделеева, навеки обессмертившим его имя, было создание периодической системы химических элементов. Периодический закон показал, что все химические элементы закономерно связаны между собой. Если элементы расположить в последовательности возрастания их атомных весов, как это сделал Д. И. Менделеев, то оказывается, что они периодически, через правильные промежутки, проявляют сходные свойства. Таким образом впервые было доказано, что все многообразие химических элементов и их соединений в природе образует стройную систему, причем свойства элементов закономерно зависят от их атомного веса или же, как было установлено позднее, от их атомного номера. Известные во время работ Д. И. Менделеева 64 химических элемента он расположил в виде таблицы, которая была названа таблицей Менделеева.
Периодический закон не только установил четкую систему взаимозависимости физических и химических свойств веществ, но и дал Д. И. Менделееву возможность предсказать открытие ряда новых, до того времени неизвестных, элементов, предопределив их свойства. В течение последующих лет исследователи открыли все недостававшие в периодической системе элементы (галлий, скандий, германий, нептуний, плутоний, америций и др.), полностью подтвердив предсказания Д. И. Менделеева.
На основании периодического закона Д. И. Менделеев внес ряд исправлений в величины атомного веса и данные о свойствах некоторых элементов, которые до этого не вызывали сомнений. Вычисленные на основе закона Д. И. Менделеева атомные веса индия, бериллия, титана, церия, урана и платиновых металлов оказались правильными, в отличие от полученных до этого экспериментальных данных. Предсказание новых элементов и исправление атомных весов известных ранее элементов на основании периодического закона были подлинным триумфом Д. И. Менделеева.
Борьба так называемой «немецкой школы» за ведущее место в Российской академии наук сказалась при выборах в Академию наук в 1880 году, когда Д. И. Менделеев был забаллотирован и академиком был избран посредственный химик Бейльштейн. Этот факт вызвал многочисленные протесты со стороны общественных и научных кругов России.
В 70–90–х годах Д. И. Менделеев изучал нефтяные, каменноугольные и железные месторождения России и Пенсильванские нефтяные залежи в Америке. На основании своих поездок и детального изучения сырьевой и топливной базы России он опубликовал ряд технико — экономических исследований и статей о необходимости подъема отечественной каменноугольной, нефтяной и металлургической промышленности, намечая многочисленные и смелые мероприятия скорейшей реализации своих проектов. В тот же период он проводил многочисленные исследования по сжимаемости газов, по сопротивлению жидкостей, изучал растворы, занимался метеорологией и вопросами воздухоплавания. В связи с последними работами, желая исследовать верхние слои атмосферы, Д. И. Менделеев в 1887 году совершил полет на воздушном шаре, наблюдая солнечное затмение. Полет на воздушном шаре в то время являлся рискованным, особенно при отсутствии специалиста — пилота, которого Д. И. Менделеев в последний момент перед подъемом попросил остаться на земле, так как выяснилось, что из‑за Дождя шар намок и не мог поднять двух пассажиров. Подобная смелость была проявлена Д. И. Менделеевым и в других случаях, когда дело касалось науки.