У середині XV ст. стосунки між литовською та українською знаттю погіршилися, особливо після того як новий великий князь Казимир Ягеллонович провів ряд реформ, спрямованих на цетралізацію влади. У 1452 р. окупована литовськими військами Волинь була на польський зразок перетворена на звичайну провінцію під управлінням урядника великого князя. У 1471 р. подібна доля спіткала й Київ із прилеглими територіями. Марно домагалися українці того, щоб таке престижне місто, як Київ, мало самоуправління чи принаймні щоб ним правив князь, а не урядник без титулу, — рештки державності Київської Русі та українського самоуправління швидко й незворотно зникали.
Піднесення Москви. Якщо великі князі литовські не дуже турбувалися тим, щоб зберегти прихильність своїх українських підданих, то великі князі московські, навпаки, плекали їхню прихильність. А вони були тепер силою, з якою належало рахуватися. Протягом поколінь, запобігаючи ласки своїх володарів — ханів Золотої Орди, князі московські посіли провідне місце серед російських князівств. Із часом свою першість вони перетворили на владу: відтак у 1474 р. Москві підкорилося князівство Ростовське, в 1478 р. — Новгород із його багатими й неозорими володіннями, а в 1485 р. — останній серйозний суперник — Тверське князівство. Маючи під своєю зверхністю майже весь Північний Схід, Москва в 1480 р. скинула вікове монголо-татарське іго. Поширення експансії Москви викликало необхідність виправдовувати її. Так постала доктрина так званого «третього Риму». В ній проголошувалося, що після падіння Риму й Константинополя Москві було призначено стати третьою вічною, священною і всесвітньою імперією. Водночас князь московський Іван III прибрав собі титул «государя всієї Русі» й проголосив, що всі землі колишньої Київської Русі мають тепер належати Москві.
Литву глибоко непокоїли дії та слова Москви. У 1490-х роках, коли військо росіян наблизилося до литовських князівств біля Чернігова, їхні православні правителі добровільно визнали зверхність Москви. Були й інші ознаки того, якою привабливою ставала Москва для українських феодалів Литовської держави. Дещо раніше, у 1481 р., князь Федір Бєльський, українізований онук Альгердаса, змовився з кількома православними князями вбити тодішнього великого князя литовського і короля польського Казимира IV і передати українські землі під владу Москви. Змову було розкрито, й хоч Бєльському вдалося втекти до Москви, інших учасників схопили і стратили.
Ще небезпечніший вибух невдоволення української знаті стався у 1508 р., коли Михайло Глинський — впливовий і талановитий магнат із західноєвропейською освітою — організував проти великого князя Сигізмунда повстання українських козаків і шляхти. У закликах до прибічників він говорив про необхідність захисту «грецької віри» та відновлення Київського князівства. Проте не встиг цей рух поширитися, як сильне польсько-литовське військо змусило Глинського втекти до Москви.
Повстання 1508 р. було визначним не тільки як вияв невдоволення українців Великого князівства, а й тим, що українська верхівка востаннє знайшла в собі внутрішню впевненість, щоб зі зброєю виступити на захист своїх прав.
Кримське ханство. І без того гострі проблеми ускладнювалися появою на півдні нової загрози. Під час повільного занепаду Золотої Орди її кочові васали — татари, що населяли Причорноморське узбережжя, відокремилися, утворивши Кримське ханство під управлінням династії Гіреїв. Незважаючи на те, що кримські хани та їхні одноплемінники — ногаї — панували на величезних степових просторах, що простягалися від Кубані до Дністра, їм не під силу було підкорити багаті генуезькі та грецькі торговельні міста на Кримському узбережжі. Тому вони шукали допомоги одновірців-мусульман, недавніх завойовників Константинополя — оттоманських турків.
У 1475 р. оттоманські ударні сили захопили Кафу й більшість інших прибережних міст. Тепер могутня й швидко зростаюча Оттоманська імперія мала свій плацдарм на Україні, який вона розширила у 1478 р., змусивши хана Менглі Гірея прийняти верховенство оттоманського султана. Проте кримські хани зберігали значну автономію й часто проводили політику, що найкраще відповідала їхнім інтересам. Серед найголовніших її кроків були часті наскоки на сусідні українські землі з метою захоплення невільників (ясиру), яких потім продавали на ринках Кафи й Константинополя.
І знову небезпека із степу нависла над осілим людом, що мешкав на його рубежах.
На початок XVI ст. стало очевидним, що Велике князівство Литовське близьке до занепаду. У 1522 р. Москва відібрала у нього Чернігів і Стародуб на північному сході України. А у 1549 та 1552 рр. воно не змогло протистояти двом великим вторгненням татар. У 1562—1570 рр. наростаюча криза сягнула критичної межі, коли Литва ув’язла в нову триваючу війну з Московським царством. Виснажені величезними воєнними витратами й опинившися перед загрозою московського вторгнення, литовці звернулися до Польщі по допомогу. Поляки готові були її надати, але за плату. Тепер головною умовою вони поставили об’єднати в одне політичне ціле Польщу з Литвою, яких до цих пір пов’язував спільний монарх.
Побоюючись поступитися своїм панівним становищем перед польськими конкурентами й занепокоєні небезпекою зростання католицьких впливів, литовські та українські магнати опиралися остаточному злиттю з Польщею. Але невдоволена пануванням магнатів середня та дрібна шляхта підтримала поляків, сподіваючися здобути собі широкі привілеї, якими користувалися польські феодали.
Скликаний у 1569 р. в Любліні королем Сигізмундом Августом сейм проходив у драматичній та гострій боротьбі. Незадоволені перебігом переговорів, магнати Великого князівства на чолі з протестантом литовським князем Кшиштофом Радзивіллом та православним українським князем Костянтином Острозьким залишили їх. У відповідь на це поляки за підтримки дрібної шляхти на Волині, у Підляшші та Києві оголосили про приєднання цих земель до Польщі. Це змусило норовистих магнатів повернутися за стіл переговорів, і 1 липня 1569 р. була укладена Люблінська унія.
Внаслідок підписання унії утворилася Річ Посполита, що мала єдиного виборного короля, сейм, гроші, податки та єдину зовнішню політику. Але Велике князівство певною мірою зберігало автономію, зокрема місцеве врядування, військо, скарбницю та систему судочинства. Та тепер до Польської корони відходили всі українські землі, що раніше належали литовцям.
Люблінська унія 1569 р. стала для українців подією величезної ваги. Попри всі свої недоліки Велике князівство Литовське протягом двох століть створювало для них сприятливі умови існування. Українські князі хоч і підпорядковувалися литовцям, однак мали великий вплив у суспільній, економічній, релігійній та культурній царинах життя. Проте, як свідчила доля Галичини, що першою потрапила під владу Польщі, з переходом українських земель від Литви до Польщі було поставлено під сумнів саме існування українців як окремої етнічної спільності.
Між XIV і XVI ст. на авансцену вийшли країни, які в наступні століття визначатимуть долю України. Спочатку вражаючих успіхів на Україні добилася Литва, правління якої виявилося найбільш прийнятним для українців. Але більш численна й агресивна польська шляхта поступово витіснила литовців з України. Вдаючись до військового тиску на Литву та дипломатичних угод, вона визначила найбагатші українські землі як головний об’єкт своєї експансії. На задньому плані вимальовувалися інші держави, котрі впливатимуть на Україну. Це — царство Московське, яке швидко зростало, й Кримське ханство, пов’язане із всемогутньою Оттоманською імперією. Очевидно, що за таких обставин перспективи досягнення Україною незалежності були малообіцяючими.