Были разработаны и опубликованы различные методы ВЭЖХ, которые, наконец, были приняты в качестве официальных методов (Taylor, 1993; ISO, 1999) или даже стали частью пищевого законодательства Франции (Arrêté du juin 11, 1987).
Стационарные фазы представляют собой преимущественно материалы с обращенной фазой, в основном материалы RP-18, но также RP-8 и другие, такие как модифицированный алкилгалогеном силикагель (Taylor, 1993).
Способы, применяющие обращенно-фазовое разделение, обычно работают с подвижными фазами метанол/вода в изократическом режиме или, чаще, с градиентным элюированием при кислых значениях pH и, наконец, с использованием УФ- или ДМД-детекции (диодно-матричный детектор). Количественное определение может быть основано на внутренних стандартах, а также на внешней калибровке, поскольку большинство обнаруженных соединений доступны в виде чистых химикатов. Время работы около 20 минут; однако с помощью специальных колонок с выбранными стационарными фазами время анализа можно сократить до менее 5 минут (Tracy et al., 2008).
Типичные параметры для анализа ВЭЖХ экстрактов ванили приведены в таблице 15.1. Выявленные соединения также опубликованы и описаны в других разделах этой книги (см. главу 12). Типичными соединениями, которые обнаруживаются с помощью этих анализов, являются ванилин, ванильная кислота, пара-гидроксибензальдегид и пара-гидроксибензойная кислота. Эти аналиты рассматриваются как импактные соединения и представляют собой типичный профиль (рис. 15.1). Простая проверка подлинности может быть выполнена на основании наличия нетипичных соединений, таких как этилванилин, а также отсутствия одного или нескольких из этих импактных соединений. Другие второстепенные соединения, обнаруживаемые с помощью ВЭЖХ, такие как анисальдегид, могут служить индикаторами, позволяющими отличить V. planifolia от V. tahitiensis (Ehlers et al., 1994; Oberdieck, 1998).
| Прибор | Agilent 1100 |
| Колонка | Lichrospher 100 RP18 (5 μm) 124 × 4 mm |
| Объем впрыска | 2 мкл |
| Элюент/градиент | Ацетонитрил/вода соотв. фосфатный буфер |
| Обнаружение | Диодно-матричный детектор |
РИСУНОК 15.1. ВЭЖХ-хроматограмма соединений ванильного экстракта.
Их количественное распределение типично для вида ванильного продукта и методики экстракции. Различные исследования изучали профиль, полученный в результате воздействия этих импактных соединений в экстрактах ванили, и обнаружили, что они специфичны и, следовательно, подходят для оценки подлинности экстракта ванили (Fayet et al., 1987; Juergens, 1981). Чтобы преобразовать профиль этих соединений в числовую шкалу, были рассчитаны отношения их концентраций и предложены пределы. Пять соотношений ванильных соединений были введены во французское законодательство для оценки подлинности ванильных продуктов (République Française, 1988). В 2003 г. эти коэффициенты были изменены Главным управлением по согласованию, объединению и борьбе с мошенничеством (DGCCRF), чтобы отразить результаты за более длительный период времени и дополнительную информацию о последних урожаях того времени (Note d’information, 2003 г.). Пределы показаны в таблице 15.2. Эта оценка подходит только для спиртовых экстрактов цельных ванильных стручков. Изменения в составе растворителя или использование альтернативных экстракционных агентов, таких как CO2, приводят к соотношениям, которые не обязательно соответствуют ограничениям, приведенным в таблице 15.2 (Quirin and Gerard, 1998). Источник ванильных стручков, используемых для приготовления экстрактов, также влияет на профиль и, следовательно, на соотношения. Дальнейшие исследования частично опровергли вывод о мошенничестве, когда соотношение находится за пределами указанных диапазонов (John and Jamin, 2004; Littmann-Nienstedt and Ehlers, 2005; Gassenmeier et al., 2008), и обосновывают пригодность так называемых соотношений. Международная организация производства ароматизаторов (IOFI) выразила в информационном письме свою оговорку в отношении применимости этих соотношений и переоценки их достоверности (IOFI Information Letter, 2000 г.), несмотря на то, что эти соотношения иногда ошибочно цитируются как «значения IOFI». Сомнительная достоверность соотношений применялась не только к ванильным стручкам и экстрактам, но также к ванильным ароматизаторам и даже к ароматизированной пище. Интерпретация соотношений для ароматизаторов и продуктов питания выходит далеко за рамки того, что серьезно исследовалось на научном уровне. Таким образом, так называемые соотношения являются предварительной проверкой подлинности ванильных стручков и их экстрактов в случае, если условия экстракции хорошо известны оценщику. Другие методы, такие как масс-спектрометрия стабильных изотопов (МССИ) или количественная сайт-специфическая спектроскопия ядерно-магнитного резонанса, обеспечивают гораздо более четкое указание на фальсификацию ванильных продуктов (Kempe and Kohnen, 1999).