Спектроскопия СФНИ-2H-ЯМР – мощный инструмент, позволяющий глубже понять биохимические механизмы путем определения содержания изотопов в определенных участках молекулы. В этом отношении МССИ, которая обычно требует сжигания пробы перед анализом, не подходит для измерения «внутримолекулярного» распределения изотопов. Фундаментальные исследования показали, что дейтерий далеко не случайно распределен в органических молекулах (Мартин и Мартин, 1981). Следовательно, необходимо определить отношения D/H в различных положениях молекулы.
Относительная чувствительность ЯМР для 13C теоретически примерно в 100 раз выше, чем для дейтерия. Но из-за того, что кинетические изотопные эффекты для углерода намного меньше, чем для дейтерия, и из-за более короткого времени релаксации для дейтерия, количественный 2H-ЯМР стал лучшим инструментом для контроля подлинности в области ароматов.
Первое применение этого метода к молекуле ванилина появилось в 1983 г. (Toulemonde et al., 1983). Теперь СФНИ-2H-ЯМР принят в качестве официального метода AOAC (№ 2006.05) для аутентификации ванилина. СФНИ-2H-ЯМР в сочетании с 13C-МССИ также позволяет характеризовать биотехнологический ванилин, полученный из феруловой кислоты, эвгенола/изоэвгенола или куркумина.
В молекуле ванилина шесть монодейтерированных изотопомеров. В 2H-ЯМР-спектрах трех различных качеств ванилина на рисунке 15.2 можно увидеть пять сигналов, два дейтерия в орто-положении попадают в один сигнал. Таблица 15.4 показывает, что ванилин, синтезированный из гваякола (2-метоксифенола) путем введения альдегидной группы, четко отделен от других вариантов высокой степенью обогащения дейтерием по карбонильной функции. Ванилин из лигнина демонстрирует истощение дейтерия во всех положениях по сравнению с натуральным ванилином, полученным из стручков ванили. Экспериментальные значения для гидроксильной группы не включены в таблицу 15.4, так как они могут быть легко искажены процессами обмена H/D.
РИСУНОК 15.2. 2H-ЯМР-спектры ванилина из ванильных стручков, синтетического происхождения (из лигнина, из гваякола) и ванилина биотехнологического происхождения из феруловой кислоты.
| Образец | Позиция в молекуле | |||
|---|---|---|---|---|
| D−C = O | Ortho | Meta | OCH2D | |
| Из стручковa | 130.8 ± 3.1 | 157.3 ± 3.0 | 196.4 ± 2.5 | 126.6 ± 1.7 |
| Из стручковb | 128.3 | 156.3 | 180.4 | 126.4 |
| Из лигнинаa | 119.9 ± 6.4 | 132.1 ± 2.6 | 168.8 ± 5.9 | 105.9 ± 1.4 |
| Из гваяколаa | 315.2 ± 56.9 | 138.8 ± 6.7 | 143.8 ± 5.3 | 139.1 ± 8.4 |
a Remaud et al., 1997.
b John and Jamin, 2004.
Также продолжается разработка количественного 13С-ЯМР. Уже получены первые характерные распределения 13C по качеству ванилина различного происхождения (Caer et al., 1991; Tenailleau et al., 2004a, 2004b).
Заключение
Аналитическое определение типичных ингредиентов ванили (экстракта) с помощью ВЭЖХ и расчет их соотношений можно рассматривать как предварительную проверку для оценки подлинности ванили. ВЭЖХ – мощный инструмент для подтверждения подлинности ванильных продуктов. Тем более, что с онлайн-методом обеспечения связи ГХ с ВЭЖХ, эти измерения стали доступны без громоздких шагов по изоляции. Многоэлементный анализ с наборами данных значений δ13C-, δ2H- и δ18O должен позволить выявлять случаи мошенничества.
Когда можно выделить достаточное количество ванилина, количественные измерения 2H- и 13C-ЯМР особенно эффективны для определения различного происхождения ванилина.
Глава 16. Использование ванили в колониальной Мексике и традиционное выращивание ванили тотонаками